通過將熒光技術(shù)引入Western Blotting這一檢測(cè)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了在同一張膜上同時(shí)使用多個(gè)探針，這樣就有機(jī)會(huì)準(zhǔn)確量化和比較每個(gè)相關(guān)條帶的所有信號(hào)。如果某種凝集素與蛋白質(zhì)條帶結(jié)合（共定位），則可精確檢測(cè)出蛋白質(zhì)的糖基化狀態(tài)。第14篇參考文獻(xiàn)中的一張圖表則是一個(gè)利用熒光技術(shù)鑒別 IgG Fc 片段與 Fab 片段糖基化狀態(tài)的很好例子，下面的實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)要介紹了這種方法。

 精選文獻(xiàn) 

• Whole sample protein glycosylation analysis (Ref. 47)

• Determine glycosylation of specific protein(s) (Ref. 30)

• Track glycosylation changes across physiological events (Ref. 28)

 實(shí)驗(yàn)流程概覽 

樣本制備

• 按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)Western Blotting流程制備樣本；

• 電泳、轉(zhuǎn)膜（建議使用PVDF膜，可以減少背景）。

封閉

• 使用Vectorlabs的CFB溶液(Carbo-Free™ Blocking,SP-5040-125),室溫孵育膜30-60分鐘?；?℃過夜孵育。

檢測(cè)

• 加入熒光標(biāo)記的凝集素(根據(jù)需求，亦可選擇使用生物素標(biāo)記的凝集素),室溫孵育一小時(shí)或者4℃過夜孵育；建議凝集素的初始工作濃度為0.5–10ug/ml。具體凝集素的孵育條件和使用濃度需要用戶進(jìn)行優(yōu)化；

• TBST室溫洗膜 5–10 分鐘，4次；

• 加入其他感興趣的熒光標(biāo)記的試劑（一抗或其他凝集素）室溫孵育一小時(shí)，或4℃過夜孵育。

顯色

• 如果使用了生物素標(biāo)記的凝集素，此步驟需要加入熒光標(biāo)記的鏈霉親和素或親和素孵育1小時(shí)；

• TBST室溫?fù)u動(dòng)洗膜 5–10 分鐘，2次。

信號(hào)收集

• 將膜進(jìn)行干燥處理；

• 圖像采集。

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